Czym jest mozaicyzm? O kontrowersjach wokół diagnostyki PGT

[SP] Jest to zjawisko, które zostało w sposób celowy powiązane z diagnostyką preimplantacyjną. Fakt ten nie wiąże się jednak z odkryciami, pozyskaniem nowej wiedzy czy chęcią pomocy i służeniu dobru pacjenta. Mozaicyzm zarodkowy definiuje się wtedy, gdy mamy do czynienia z różnorodnością genetyczną w obrębie jednego organizmu. Mówiąc prościej, jest to sytuacja, w której jedna komórka w zarodku ma inną liczbę chromosomów niż komórka zlokalizowana w innej części zarodka. Właśnie tę niejednolitość zobaczylibyśmy, gdybyśmy zrobili badanie PGT-A.

[SP] Badacze, którzy ponad 30 lat temu zajmowali się rozwojem zarodkowym, jeszcze zanim zaczęto łączyć to z diagnostyką preimplantacyjną, zadawali sobie pytanie, czy wszystkie komórki są jednolite, czy może jest jednak tak, że różne mechanizmy molekularne wpływają na ich różnorodność. Od ok. 20 lat wiemy, że czasami występują komórki o odmiennym statusie genetycznym. Należy jednak zadać sobie pytanie, czy będzie to miało przełożenie na proces leczenia in vitro.

Zarodek w 3. dobie hodowli, czyli wtedy, kiedy posiada już od 8 do 10 blastomerów (1), może zawierać komórkę, która jest odmienna od pozostałych. Tę samą sytuację możemy zaobserwować, badając blastocystę (2), która zawiera już 150 komórek. Jeżeli pobierzemy kilka próbek do badań i okaże się, że jedna z nich da nam wynik odbiegający od pozostałych, zauważymy, że w pierwszym przypadku taka sytuacja ma miejsce w 10-12%, natomiast na drugim etapie rozwojowym to zjawisko jest już zredukowane do 1-2%. Są to doniesienia naukowe z badań prowadzonych przed 2010 rokiem, czyli dużo wcześniej niż w przestrzeni publicznej pojawił się termin „mozaicyzm” w znaczeniu dla diagnostyki preimplantacyjnej. Jest to więc zjawisko, które zostało scharakteryzowane i wiemy, że występuje w stopniu marginalnym.

[SP] Mozaicyzm powstaje z trzech mechanizmów molekularnych, które dotyczą zmian w pojedynczych komórkach. Naukowcy odkryli to, zastanawiając się nad innym zjawiskiem, zwanym UPD (ang. Uniparental disomy), czyli sytuacją, w której nie mamy danej pary chromosomów od obojga rodziców, tylko oba chromosomy mamy np. od matki. Właśnie podczas tych badań odkryto mechanizmy, które mogą być odpowiedzialne za manipulowanie liczbą poszczególnych par chromosomów doprowadzając do sytuacji, w której komórka posiadająca trzy chromosomy danej pary pozostanie tylko z dwoma. W ten sposób tworzy się uniparentalna disomia, czyli nie zostaje zachowana różnorodność.

Może się też zdarzyć tak, że pozostanie jeden chromosom, za co odpowiada kolejny mechanizm molekularny. Istnieje również możliwość, że w komórce, w której nieprawidłowo powstał jeden chromosom, pojawi się drugi (endoreduplikacja), sprawiając, że odzyskamy disomiczny fenotyp (3). Należy jednak zaznaczyć, że mówimy o zasięgu komórkowym takich mechanizmów, mając na myśli jedną komórkę. Jeżeli doszło do takiego wydarzenia, które notabene prowadzi do uniparentalnej disomii, będącej niezwykle rzadkim zjawiskiem, możemy odnaleźć osoby w społeczeństwie, które posiadają dwa chromosomy od jednego rodzica. Natomiast komórkowo, żeby to miało znaczenie dla diagnostyki preimplantacyjnej, wydarzenia te musiałyby mieć miejsce w określonym momencie i musiałyby dotyczyć określonego obszaru zarodka lub całego zarodka. Odzyskanie prawidłowego genotypu w sytuacji, gdy komórka jajowa zawierająca niewłaściwą liczbę chromosomów, bo wydaliła złą zawartość do ciałek kierunkowych (4) i pozostała z nieprawidłowymi chromosomami graniczy jednak z cudem i jest obserwowane jedynie w tzw. systemach modelowych. Polega to na tym, że badacze przeprowadzają np. 70 hodowli przez 70 tygodni, wykonując pasaż komórkowy (5) co 4-5 dni. Po 70 tygodniach hodowli w całej puli komórek udaje się zazwyczaj odnaleźć 4 komórki prawidłowe. Oznacza to, że tylko 4 z nich po wielokrotnych podziałach odzyskały prawidłową zawartość chromosomalną. Nie mówimy więc o rozwoju zarodkowym, czyli 3 dniach, które są decydujące.

Co to oznacza dla diagnostyki preimplantacyjnej? Trzeba wiedzieć, że istnieją mechanizmy molekularne, które mogą doprowadzić do tego, że jedna komórka będzie się odróżniała od innych, jednak zjawisko mozaicyzmu nigdy nie stanowiło i nie stanowi znaczącego czynnika w prowadzeniu diagnostyki preimplantacyjnej. Informujemy pacjentów o możliwości wystąpienia mozaikowatości na poziomie 1-2%, jednak przyznam szczerze, że przez tyle lat badania zarodków przy skali kilka tysięcy rocznie nie mieliśmy przypadku, aby miało to wpływ na efekty leczenia. Jeżeli mozaicyzm miałby się utrzymać do etapu prenatalnego, wiedzielibyśmy o tym.

[SP] Punkt odcięcia to wartość zmiennej diagnostycznej, która optymalnie dzieli materiał badawczy na dwie grupy: tę, w której występuje dane zjawisko i tę, w której dane zjawisko nie występuje. Oczywiście możemy zastanawiać się, kiedy zaczyna się status pośredni, czyli kiedy mamy do czynienia z disomią (podstawową zawartością chromosomów), a kiedy przekraczamy tę granicę i kryje się za nią trisomia (obecność dodatkowego chromosomu w danej parze). Właśnie wtedy mówimy o odcięciach na określonym poziomie procentowym. Wyniki mogą się jednak od siebie różnić w zależności od wybranego laboratorium, co potwierdziło w swoich badaniach Europejskie Towarzystwo Rozrodu Człowieka i Embriologii (European Society of Human Reproduction and Embryology – ESHRE).

Kontrowersje wokół badań doprowadziły do tego, że coraz częściej słychać głosy, które mówią o tym, że nie warto wykonywać diagnostyki preimplantacyjnej, bo istnieje mozaicyzm. Trafiłem również na wyliczenia, ile komórek trzeba byłoby zbadać, aby dowiedzieć się, że zarodek posiada taki właśnie genotyp. Proszę pamiętać jednak o tym, że większość z tych przedstawień lub opisów to modele matematyczne, które nie uwzględniają aspektu biologicznego. Nie dowiemy się z nich, jak te komórki powstają, w jaki sposób się różnicują i czemu te mechanizmy służą.

W Laboratoriach Genetycznych INVICTA wprowadzono (w 2013 r.) po raz 1. na świecie technologię NGS do diagnostyki preimplantacyjnej. Świat to zauważył. Można spojrzeć do danych SART, czyli amerykańskiego towarzystwa zbierającego dane z 90% klinik niepłodnościowych w Stanach Zjednoczonych i widzimy, że właśnie od tego roku rośnie ilość cykli wykonywanych z diagnostyką preimplantacyjną. Drugi fakt jest taki, że za naszym przykładem, świat ruszył, ale z pewnym opóźnieniem. Od roku 2016, od zjazdu Międzynarodowego Towarzystwa Diagnostyki Preimplantacyjnej (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society – PGDIS) w Bolonii, zaczęto propagować NGS do wykorzystania w obszarze diagnostyki preimplantacyjnej, czyli 3 lata po tym, jak INVICTA tę metodę zastosowała właśnie w diagnostyce PGT. Wcześniej wykorzystywano tzw. comprehensive screening, czyli mikromacierze, które zawierały badanie wszystkich 24 chromosomów, natomiast każdy chromosom w tamtej technologii był sprawdzany co najwyżej kilkadziesiąt razy. W technologii NGS sprawdzamy każdy chromosom 10-20 tysięcy razy, co pozwala nam widzieć mozaicyzm występujący w skali 15-20% wszystkich zarodków.

[SP] Prawda jest taka, że wykonując to badanie, nawet w technologii NGS, tak naprawdę nie badamy mozaikowatości zarodka. Obserwujemy pewne przesunięcie sygnału, którego granice są definiowane jako granice mozaikowatości zarodka, ale to jest zwykłe przesunięcie semantyczne, zastosowanie pewnej figury retorycznej. Pacjenci są informowani w wynikach diagnostyki preimplantacyjnej o tym, że zarodek jest mozaikowaty w iluś procentach, np. ze stanu disomicznego w stronę trisomii o jakiś fragment. Czynników, które wpływają na przesunięcie sygnału, jest dużo i jednym z nich jest właśnie mozaikowatość zarodka, ale żeby móc ją określić, trzeba byłoby przeprowadzić dysekcję zarodka (6), więc nie mielibyśmy czego transferować. W rutynowo wykonywanym badaniu PGT-A technologią NGS określa się więc domniemaną mozaikowatość zarodka.

Dlaczego mimo tego wiele laboratoriów zdecydowało się na zmianę? Ponieważ mikromacierze miały swoje ograniczenia. Technologia NGS dodatkowo okazała się wygodniejsza. Notabene to nie prawda, że za pomocą mikromacierzy nie da się wykryć mozaicyzmu – po prostu oprogramowanie do mikromacierzy jest techniką bazującą na fluorescencji, czyli na kolorach, do których musi przypisać dane, więc jest zmuszane do szufladkowania. W momencie, w którym laboratoria rozwijające technologię NGS kupiły firmę, która do tej pory dominowała na rynku mikromacierzy stosowanych w diagnostyce preimplantacyjnej, uwolniły niejako to oprogramowanie i okazało się, że możemy identyfikować stany pośrednie sygnałów, które nazwano mozaicyzmem zarodkowym. Nadal nie ustalono jednak konsensusu, w jaki sposób oznaczać te granice i raczej już go nie będzie, bo w międzyczasie pokazano, że nie da się stwierdzić mozaikowatości zarodka w tak krótkim czasie.

[SP] Ludzie mówiący o tym, żeby informować o mozaikowatości zarodka, doprowadzili do sytuacji, w której 90% pacjentek jednocześnie chciało znać ,,diagnozę” i nie chciało transferu, aby nie doszło do poronienia. Tym sposobem diagnostyka, która miała prowadzić i prowadziła do redukcji poronień obniżając ich liczbę nawet 3-krotnie w cyklach z PGT-A, zaczęła budzić wątpliwości pacjentek. My nigdy w Laboratoriach Genetycznych INVICTA nie raportowaliśmy mozaicyzmu, przez co byliśmy przez lata nękani. Byliśmy prekursorami tej techniki (czyt. NGS), wiedzieliśmy, skąd wynikają różnice w sygnałach, które atrybują do domniemanej mozaikowatości zarodka i chroniliśmy przed taką właśnie interpretacją naszych pacjentów, a pośrednio też i lekarzy, którzy musieliby borykać się z tym zjawiskiem, albo z tym opisem domniemanego zjawiska.

Efektem tego absurdu są depozyty zarodków, których pary się obawiały. Aż 90% transferów zostało odwołanych z powodu wyników wskazujących na mozaikowość zarodka. Przy założeniu, że granica przesunięcia sygnału mozaikowatości wynosi 20-80% bardzo dużo różnorodnych sytuacji chowamy do tej samej szuflady.

W Klinikach INVICTA mamy jeden próg – 50%. Jeżeli zmiana następuje w tym obszarze lub większym danego chromosomu, bez względu na przyczynę raportujemy taki zarodek jako nieprawidłowy. Nie definiujemy tego jednak jako ,,mozaikowość”.

Po tym, jak na głos wybrzmiały rekomendacje American Society for Reproductive Medicine (ASRM), aby nie raportować mozaikowatości, laboratoria się z tego wycofały. Problemem jest jednak to, że nie zostały z tego rozliczone.

[SP] Dokładnie. Dodatkowo, jeśli ktoś stoi przed decyzją o przystąpieniu do leczenia in vitro i chce dowiedzieć się więcej na ten temat, nie polecamy literatury z ostatnich lat (2016-2023), ponieważ znajdzie tam manipulacyjną retorykę dotyczącą nazewnictwa statusu genetycznego w zarodku.

[SP] Nie przejmujemy się mozaicyzmem, bo widzimy, że to nie jest zjawisko, które jakkolwiek rzutuje na efektywność narzędzia, jakim jest diagnostyka PGT-A. Takie jest nasze stanowisko na dzisiaj i takie było, zanim zaczęto medialnie propagować mozaicyzm.

1. Blastomery – komórki, które powstają w wyniku kolejnych podziałów mitotycznych zarodka w trakcie wczesnego rozwoju embrionalnego.
2. Blastocysta – zarodek w 5-6 dniu zapłodnienia.
3. Disomiczny fenotyp – sytuacja, gdy oba chromosomy z jednej pary pochodzą tylko od jednego z rodziców.
4. Ciałka kierunkowe – niewielkie komórki powstające w czasie dojrzewania komórek jajowych w jajnikach.
5. Pasaż komórkowy – przeniesienie komórek ze starego naczynia do nowych naczyń, zawierających świeżą pożywkę.
6. Dysekcja zarodka – analiza wzorców ekspresji genów we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego.