W celu pobrania materiału do analizy genetycznej, na chwilę obecną stosowane są 3 metody:
1) Biopsja blastomeru – metoda stosowana najczęściej. Przeprowadzana jest w 3 dniu po zapłodnieniu. Do biopsji kwalifikuje się jedynie zarodki 6-8 komórkowe. Po otwarciu osłonki przejrzystej zarodka (mechanicznie, enzymatycznie lub światłem laserowym) pobierany jest 1 lub rzadziej 2 blastomery [5]. Transfer nieobciążonego genetycznie zarodka wykonywany jest w 5 dniu po zapłodnieniu komórki jajowej.
2) Biopsja I lub II ciałka kierunkowego. Ciałka kierunkowe są to fragmenty cytoplazmy w obrębie komórki jajowej, zwierające wyłącznie matczyny materiał genetyczny. Powstają podczas I i II podziału mejotycznego oocytu. Nie pełnią żadnej fizjologicznej funkcji w dalszym rozwoju zarodka. Procedura ich pobrania nie odbiega od stosowanej przy biopsji blastomerów. I ciałko kierunkowe pobierane jest z oocytu przez zapłodnieniem, natomiast II ciałko kierunkowe po zapłodnieniu. Metoda ta pozwala uniknąć ingerencji w materiał genetyczny zarodka. Ograniczeniem jest tu jednak niemożliwość diagnostyki materiału genetycznego przyszłego ojca, czy wykrywanie wad genetycznych powstałych w przebiegu rozwoju zarodka [5].
3) Biopsja komórek trofoektodermy (TF) zarodka. Wykonywana jest w 5 dniu po zapłodnieniu komórki jajowej. Komórki do analizy pobierane są z trofoektodermy. Zarodek do badania musi znajdować się w stadium blastocysty. Do badania pobiera się kilka komórek pochodzących z obszaru trofoektodermy. Badanie to ogranicza zakres wybranych chromosomów w sytuacji, gdy transfer zarodka planowany jest na piątą dobę.
Zaletą biopsji TF jest duża ilość materiału do badania, aczkolwiek krótki czas na analizę oraz brak pewności, że TF odzwierciedlają rzeczywiste DNA węzła zarodkowego ograniczają jej zastosowanie [5].
W diagnostyce preimpalntacyjnej do analizy genetycznej już od samego początku wykorzystywano PCR (łańcuchową reakcję polimerazy ang. Polymerase Chain Reaction) oraz FISH.
PCR umożliwia powielenie wybranego fragmentu DNA dzięki czemu otrzymujemy wiele jego kopii. PCR stosowane jest w diagnostyce chorób jednogenowych. Ograniczeniem PCR jest ryzyko kontaminacji obcego DNA (np. pochodzącego z plemnika, gdy jako procedurę zapłodnienia komórki jajowej stosowano klasyczną metodę zapłodnienia a nie ICSI). Kolejną wadą jest efekt allele drop-out (ADO), w którym jeden z alleli heterozygoty zostaje nieprawidłowo amplifikowany, czego konsekwencją mogą być zarówno fałszywie dodatnie jak i fałszywie ujemne wyniki. Zastosowanie zmodyfikowanych metod PCR takich jak multiplex PCR, fluorescencyjny PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym pozwalają uniknąć w/w problemów [5,9]. W diagnostyce PGT z wykorzystaniem PCR stosuje się również powielenie całego genomu badanej komórki – WGA (ang. Whole Genom Amplification). Procedura ta zalecana jest przy małej ilości materiału do badania [9]. Wyniki fałszywej oceny genetycznej zarodków dla chorób dziedziczonych autosomalnie recesywnie wynosi 2%, a dla cech dominujących 11% [10].
Diagnostyka PGT z wykorzystaniem techniki FISH wykorzystuje sondy fluorescencyjne w celu oceny aneuploidii autosomów, wykrywaniu chromosomów płci i aberracji chromosomalnych. Fałszywe wyniki oceny aneuploidii na podstawie 1 blastomeru wynosi 7%, z czego 6% to mozaiki, stąd też dla podniesienia czułości metody zaleca się biopsję 2 blastomerów [5].
Wyniki właściwej diagnozy PCR dla biopsji 1 komórki w porównaniu dla 2 komórek są następujące 88,6% i 96,4%. W przypadku FISH różnice nie są istotne statystycznie. Różnice wartości wskaźnika żywych urodzeń po PCR lub FISH nie były istotne statystycznie [12].
Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH ang. Comparative genomic hybridization) i mikromacierz CGH (aCGH ang. Array comparative genomic hybridization) dopiero od kilku lat są wykorzystywane do selekcji zarodków o wyższym wskaźniku implantacji, diagnostyki anueploidii czy mozaicyzmu. CGH umożliwia analizę różnic w ilości kopii DNA całego genomu, tym samym daje szansę łączonej diagnostyki różnych mutacji punktowych lub mutacji punktowych i aneuploidii. Na chwilę obecną niewystarczająca skuteczność i złożoność opracowanych metod oraz wysokie koszty ograniczają ich stosowanie na większą skalę. Zdecydowaną wadą tych metod jest długi czas oczekiwania na wynik badania (CGH do 72 godz., aCGH do 30 godz.). Zarodki lub oocyty na czas badania muszą być poddane krioprezerwacji [3,16]. Witryfikacja jest nową metodą mrożenia zarodków i oocytów opracowaną przez M. Kuwayamę. Udowodniono, że zwiększa wskaźnik urodzeń zdrowych dzieci [17] oraz przeżycia zarodków po biopsji blastocysty w porównaniu ze standardowymi metodami krioprezerwacji [16]. Zhang i wsp. badali wskaźnik przeżycia wytryfikowanych zarodków na różnych stadiach rozwoju poddanych biopsji w 3 dniu od zapłodnienia w porównaniu do zarodków bez biopsji. Wyniki badania pozwalają postawić tezę, że embriony po biopsji, krioprezerwowane na wyższym etapie rozwoju mogą być po rozmrożeniu wykorzystane z zadowalającym efektem [18].
Na chwilę obecną możliwa jest teoretycznie PGT wszystkich chorób monogenetycznych: dziedziczonych autosomalnie dominująco (np. choroba Huntingtona, zespół Marfana, dystrofia miotoniczna), autosomalnie recesywnie (np. mukowiscydoza, β- talasemia, rdzeniowy zanik mięśni), chorób sprzężonych z płcią ( np. dystrofia mięśniowa Duchena, zespół łamliwego chromosomu X, hemofilia A) i aberracji chromosomalnych: aneuplodii, translokacji zrównoważonych oraz robertsonowskich [4].
Aneuploidie są znanym czynnikiem sprawczym niepowodzeń technik rozrodu wspomaganego i nawracających poronień. U około 70% zarodków powstałych w wyniku zapłodnienia IVF występuje co najmniej jeden z pięciu zaburzeń chromosomalnych (X,Y,13,18,21) [11]. Wraz z wiekiem matki rośnie ryzyko wystąpienia trisomii chromosomu 21. Potwierdzono zwiększone ryzyko poronienia, urodzenia martwego płodu lub z wadami wrodzonymi, w przypadku gdy jedno z rodziców jest nosicielem wzajemnej translokacji zrównoważonej [6]. Nosiciele wzajemnych translokacji zrównoważonych mają wyższe ryzyko wystąpienia poronień niż nosiciele translokacji Robertsonowskich. W grupie pacjentów z obciążeniem w wywiadzie nawracającymi poronieniami i brakiem żywych urodzeń PGT zmniejsza ryzyko poronień i zwiększa wskaźnik żywych urodzeń [13].
O ile skuteczność PGT dla grupy wysokiego ryzyka przekazania chorób genetycznych potomstwu jest udowodniona to stosowanie PGS budzi wiele kontrowersji. Geraedts i wsp. (2010) powołując się na randomizowane badania stwierdza, że PGS nie zwiększa wskaźnika żywych urodzeń u par z zawansowanym wiekiem matki, niepowodzeniami IVF/ICSI [14]. Ponadto PGS może w tej grupie obniżać wskaźnik ciąż i donoszonych ciąż [15].
Podsumowując diagnostyka preimplantacyjna stanowi alternatywę dla diagnostyki prenatalnej wśród par decydujących się na ART. Dzięki szerokim możliwościom diagnostyki chorób genetycznych daje nie tylko możliwość posiadania zdrowego potomstwa, ale również szansę na dziecko dla par z nawracającymi poronieniami czy niepowodzeniami ART, a także budzącym pewne kontrowersje doborem rodzeństwa pod względem zgodnego HLA w celu pozyskania komórek macierzystych z krwi pępowinowej np. w celu przeszczepu komórek macierzystych dla rodzeństwa [2].
Autorzy artykułu: A. Litwin, dr n. med. J. Liss, dr hab. n. med. K. Łukaszuk, prof GUM-ed
